CCK-8（Cell Count Kit-8）是一种利用WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）快速检测细胞增殖或毒性试验的方法。WST-8是一种类似MTT的四唑盐，在电子载体的存在下，被活细胞内的脱氢酶还原生成水溶性的橙黄色Formazan（甲臜），通过比色法检测甲臜生成量来反映试验中活细胞的数量。



操作方法：
1. 标准曲线制作
  a. 接种细胞：接种不同细胞密度梯度的细胞至96孔板（建议设5 ~ 8个梯度），每孔100 μl，每组设置3~5个复孔，置于37℃，5% CO₂培养箱；
  b. CCK-8孵育：接种4 h后，待细胞完全贴壁，在每孔中加入10 μl的CCK-8试剂，轻轻混匀，并将培养板置于37℃，5% CO₂培养箱中孵育1~4 h；
  c. 上机检测：将孵育后的细胞培养板置于酶标仪上，在450 nm处检测其吸光值；
  d. 制作标曲：制作以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线，参照标准曲线可以计算出样品组的细胞数量；
 
2. 细胞毒性检测
  a. 接种细胞：接种对数期的细胞至96孔板，密度约1~5×10³个/孔，每孔100 μl，每组设置3~5个复孔，置于37℃，5% CO₂培养箱；
  b. 样品处理：待细胞贴壁后，加入不用浓度的药物或样品处理细胞，然后置于培养箱中孵育一定的时间（如：24 h、48 h、72 h）；
  c. CCK-8孵育：每孔加入10 μl的CCK-8试剂，轻轻混匀，并将培养板置于37℃，5% CO₂培养箱中孵育1~4 h；（可进行预实验确定孵育时间）；
  d. 上机检测：将孵育后的细胞培养板置于酶标仪上，在450 nm处检测其吸光值；


图.2. 以Hela细胞为例，细胞按1.25×10³ ~ 20×10³个/孔的密度梯度接种至96孔板中，培养4 h后，待细胞完全贴壁，
每孔加入10 μl的CCK-8试剂，轻轻混匀，置于培养箱中孵育1 h后，在450 nm处检测其吸光值，并制作标准曲线。

注意事项：
1. 接种对数期生长的细胞，注意使细胞分散均匀，确保每个复孔中的细胞数量一致，减少误差。
2. 为了达到最佳的实验效果，建议先进行预实验，确定最佳的细胞接种密度及CCK-8试剂孵育时间；以贴壁细胞为例，接种密度约1~5×10³个/孔；孵育时间为1~4 h，多数细胞孵育约30 min即可观察到明显的颜色变化。
3. 设置空白对照，在无细胞的培养基中加入CCK-8检测，去除本底对吸光值的干扰。
4. 如果OD值太高，建议降低细胞接种密度或减少CCK-8试剂孵育时间。
 
储存条件
4℃保存，1年有效；-20℃保存，2年以上有效；
仅供科学研究使用