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Biocyto SafeRed 10000x in water Biocyto SafeRed 10000x in water

Biocyto SafeRed 10000x in water

产品编号:SD-001
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产品包装:   SafeRed® 10000x Nucleic Acid Dye  500uL/支;   
                    GelGreen® 10000x Nucleic Acid Dye  500uL/支               
储存条件:  室温避光可保存24个月。
操作步骤:
一.胶染法(推荐方法,用法类似EB)
制胶时加入SafeRed 核酸染料(染料灵敏,每100mL 琼脂糖溶液中加入10μL SafeRed 原装液即可)。 按常规方法电泳。
1. 实验室材料和试剂:
  1. 实验样品:质粒DNA,DNA marker(国产的DNA marker浓度太高,至少稀释2~3倍后使用)
  2. TBE缓冲液配置:10X TBE电泳缓冲液[Tris 107.8146g (890mM),硼酸55.0287g(890mM),EDTA 5.845g(20mM),加NaOH约4g调节pH=8.3;定容1000mL];用ddH2O稀释10倍配制1X TBE电泳缓冲液。
  3. TAE缓冲液配置:50X TAE电泳缓冲液[Tris 242g (2M),EDTA 37.2g(100mM),加醋酸约57ml调节pH=8.5;定容1000mL];用ddH2O稀释50倍配制1X TAE电泳缓冲液。
  4. 溴酚蓝指示剂,1%的西班牙琼脂糖凝胶
  5. 仪器:电泳仪(130v),移液器(0.5~10ul),凝胶成像仪
2. 实验步骤:
  1. 制胶:将0.5g琼脂糖溶于50mL 1X TBE电泳缓冲液中,加热至琼脂糖完全融化。将融好的琼脂糖溶液室温放置50℃左右加入5ul的SafeRed凝胶电泳染料,摇匀。
  2. 倒胶:将制好的琼脂糖凝胶缓慢倒于制胶托盘内,避免产生气泡。将点样梳子垂直置于电泳胶膜的一端,距离托盘底部约1mm。放置时尽量保持平稳,切勿晃动。
  3. 置胶:待约30分钟左右胶体充分凝固后,缓慢垂直向上拔起点样梳子,切勿用力过猛。(夏季适当延长凝胶时间)
  4. 将琼脂糖凝胶放入电泳槽内,加入电泳缓冲液,使电泳缓冲液液面高于凝胶面约1~2mm。
  5. 将混合溴酚蓝指示剂的DNA样本(1ul溴酚蓝与2ul DNA标本混合)加入到点样孔内。
  6. 盖上电泳槽盖,开启电源,使DNA从负极移向正极恒压电泳(电压恒定在120~130v之间,一般可选择130V)。
  7. 当DNA条带距离点样孔约1~2cm后关闭电源,(约30~40分钟)取出凝胶。
  8. 用 302nm 激发的 UV 凝胶成像系统观察结果。
*注:此方法染色染料用量相对较少。染料加入胶中可直接使用微波炉加热,制好的胶溶液可以在室温下保存直至用完。
优化电泳条件参考事项:
  • 因为EB是插入DNA内部变成一个整体分子,所以不容易出现迁移/弥散的问题,而大分子的SafeRed与DNA是通过静电吸引非共价结合的,在DNA外面就容易出现条带迁移,特别是大片段DNA!
  • 1. 鉴于SafeRed的高灵敏性,建议减少DNA的上样量,推荐已知浓度样品的上样量为50~200ng/泳道(8泳道小胶孔)。对于未知浓度的样品,尝试1/3或1/5的常用上样量。国产的DNA marker浓度太高,至少稀释一倍后使用!
  • 2. 更换电泳缓冲液,新配置的电泳液效果好!推荐用1×TBE缓冲液代替TAE,因为含硼酸盐的试剂导电性能更好。
  • 3. 电泳时电压不宜过高,一般不要超过130V。
  • 4. 染料无需低温冷藏,室温下储存即可,以避免沉淀,若发现沉淀,请将染料加热至45~50℃,2min,搅拌溶解,不影响使用效果。
  • 要得到漂亮胶图与多种因素有关,需要在EB的基础上优化电泳条件,请尝试:marker浓度和样品浓度稀释一倍;降低琼脂糖浓度;选用更长的凝胶;降低电压延长凝胶时间以保证边缘清晰;改进上样技巧或选择泡染法染色。SafeRed染料由于染料分子偏大,会对marker的大片段迁移有一定影响,偶尔会造成拖带,微笑条带等情况。减少DNA上样量。污染和微笑条带往往是过量的DNA样本造成的。推荐的泳道和已知浓度的样品的上样量为50-200ng/泳道。对于未知浓度的样品,尝试1/2或1/3的常用上样量; 配制百分比浓度小的琼脂糖凝胶。高分子量的DNA在低百分比的琼脂糖凝胶分离效果比较好。
  • 染料过于灵敏,建议marker浓度稀释一倍,特别是含大片段多的marker!目前国产的marker是基于EB染料开发的酶切的混合片段,浓度对于SafeRed是偏高的;另外,EB显示不出来酶切的混合片段的杂带,SafeRed的高灵敏性会显示出来。少数情况下质粒经某些酶切后的DNA样品会出现拖尾和分辨率降低,请使用后染法。
  • 染料过于灵敏,建议未知浓度的样品的稀释一倍后上样,特别是含大片段多的样品。
  • 与EB相比,SafeRed电泳电压要低一些,跑胶的时间长一些。
  • SafeRed染料和样品混合后,点样到琼脂糖凝胶中,不推荐这种点样法。
  • 由于SafeRed具有良好的热稳定性,可以在热的琼脂糖溶液中直接添加,而不需要等待溶液冷却。摇晃,振荡或者翻转以保证染料充分混匀。也可以选择将SafeRed储液加到琼脂糖粉末和电泳缓冲液中,然后用微波炉或其他常用方式加热以制备琼脂糖凝胶。SafeRed兼容所有常用的电泳缓冲溶液。
  • 如果总是看到条带弥散或分离不理想,为了避免染料可能对DNA迁移的干扰,建议使用电泳后染胶。使用泡染法染色以确认问题是否与染料有关。如果染色后问题依旧存在,则说明问题与染料无关!
*此方法不适合预制聚丙烯酰胺凝胶,对于聚丙烯酰胺凝胶请使用泡染法。
 
二.泡染法
(1)按照常规方法进行电泳。 用于胶回收等高浓度DNA样品强烈推荐泡染法!
(2)用H2O将SafeRed® 10,000× 储液稀释约3,300倍到0.1M NaCl溶液中,制成3× 染色液。(例如将15μL SafeRed® 10,000× 储液加入到50mL 0.1M NaCl溶液中)。
(3)将凝胶小心地放入合适的容器中,如聚丙烯容器中。缓慢加入足量的3× 染色液浸没凝胶。室温振荡染色30min左右,最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有不同。对于含3.5~10%丙烯酰胺的凝胶,染色时间通常介于30min到1h,并随丙烯酰胺含量增加而延长。
(4)用 302nm 激发的 UV 凝胶成像系统观察结果。
*注意事项:用泡染法染色时,染料用量较多。单次使用的染色液可重复使用3次左右;3× SafeRed®染色液可以大量制备,在室温下避光保存直至用完。
三.核酸电泳的PAGE步骤:
1)将TBE制备的凝胶放入电泳槽中,用夹子夹住边缘。
2)用配置凝胶溶液同一批次的5×TBE灌满缓冲液槽。用注射器排除凝胶底部的气泡。
3)用注射器吸取1×TBE冲洗加样孔。将DNA样品和适量的6×凝胶上样缓冲液混合,用微量移液管加入加样孔。
4)将电极与电源相连(正极接下槽),打开电源一般90V;1~8V/cm。进行电泳9h。
5)电泳至标准参照染料迁移至所需位置(一般是电泳到二甲苯完全迁出,溴酚蓝距底边2~3cm停止)。关闭电源,拔掉插头,弃去电泳槽中的电泳液。
6)将凝胶取下来放入,染色皿中,加3X SafeRed的1X缓冲液中的振荡染色30-60分,放置在紫外检测即可。
*注意事项:与琼酯糖凝胶不同,不能用预染或点染的方法;只能用泡染的方法显色,由于聚丙烯酰胺比较致密,染料不容易深入,显色效果没有琼酯糖凝胶好。
特别提醒:如果用的是紫外成像仪,请选择SafeRed;如果使用激光成像仪或在可见光下观测,请选择GelGreen。
 
  1. 带形清晰整齐:第三代SafeRed®和GelGreen®完全克服了原装国外相同染料分不开大片段DNA的缺点,所有电泳条带清晰整齐美观。
  2. 安全无毒:独特油性大分子使其不能穿透细胞膜进入细胞, Ames-test实验表明,该染料的没有EB类似的诱变性。
  3. 迁移率好:EB小分子很快跑出胶外,所以EB容易导致小DNA片段看不清,我们的大分子SafeRed完全克服这一点。
  4. 定量准确:适用于核酸分子大小的确定和定量,EB对小DNA片段定量不准确。
  5. 染色均匀:电泳时染色均匀,靠近负极凝胶和靠近正极端的亮度一样。EB会导致胶的整体背景稍微高些,经常出现阴   阳背景(胶的背景一部分亮一部分暗);EB长时间、长距离的电泳,EB信号强度会相应下降。我们的大分子SafeRed完全克服这一点。
  6. 灵敏度高:适用于各种大小片段的电泳染色,对核酸迁移的影响小于SYBR Green I。
  7. 稳定性高:耐热,可加在缓冲液里,100℃溶解凝胶,防止染色剂没充分混匀。适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶;室温下在酸或碱缓冲液中极其稳定。
  8. 耐光性强:实验室的日常光线照射环境下可以常温放置24个月。
  9. 信噪比好:样品荧光信号强,背景信号低,荧光亮度是EB的十倍以上,肉眼可观测到亮度明显比EB强,EB会导致胶的整体背景稍微高些,经常出现阴阳背景。
  10. 操作简单:与EB用法完全一样,在预制胶和电泳过程中染料不降解;而电泳后染色过程也只需30 分钟且无需脱色或冲洗 ,即可直接用紫外凝胶透射仪观察。
  11. 适用范围广:可选择电泳前染色(胶染法)或电泳后染色(泡染法);适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳;可用于 dsDNA、ssDNA 或 RNA 染色。
  12. 完美兼容:与EB有相同的光谱特性,无需改变滤光片及观察装置:标准的 EB 滤光片或 SYBR 滤光片都适用,使用与观察EB相同的普通紫外凝胶透射仪观察即可,在 300nm 紫外光附近可得到最佳激发。
SafeRed®和GelGreen®常见问题
 
关于marker跑电泳出现分辨率不高现象:
国产的DNA marker浓度太高,至少稀释一倍后使用!
Invitrogen's 1kb Plus DNA Ladder 的marker与Gel Red匹配度最好。SafeRed比EB分子大(也是由于大分子特性,所以不会透过细胞膜进入人体产生伤害)。大分子的染料在预制胶中对DNA的迁移有一定影响。建议采用后染法,不会破坏胶中的DNA样本,保证了DNA迁移的真实水平。不同于EB,你不用在对染后的胶进行脱色。
SafeRed&GelGreen常见问题:
Q:  污染或微笑的DNA条带或错误的DNA迁移条带?
A:  客户为方便用SafeRed预制凝胶。由于SafeRed®和GelGreen®是为安全而设计的分子量较大的高效亲和型染料,在预制凝胶电泳中它们可以影响DNA的迁移。尤其是国产的一些限制性酶切的DNA样本,可能会在SafeRed®预制凝胶中异常迁移。下列建议可提高预制凝胶中的条带分离效果。
  1. 鉴于SafeRed的高灵敏性减少DNA上样量。污染和微笑条带往往是过量的DNA样本造成的。推荐的泳道和已知浓度的样品的上样量为  50-200ng/泳道。对于未知浓度的样品,尝试1/2或1/3的常用上样量
  2. 减少SafeRed在凝胶中的总量,SafeRed再稀释一倍后使用比如用0.5X的浓度来代替1X的浓度。
  3. 制百分比浓度小的琼脂糖凝胶。高分子量的DNA在低百分比的琼脂糖凝胶分离效果比较好。
  4. 更换电泳缓冲液。 TBE缓冲液比TAE缓冲液的效果更好,因为含硼酸盐的试剂导电性能更好。
  5. 为了避免染料可能对DNA迁移的干扰,建议使用电泳后染胶。如果跑胶程序需要的上样量超过推荐量,建议使用电泳后染色法。
Q: 荧光弱,时间久染料性能降低,或使用后染法染料仍然在琼脂糖凝胶中。
A :  染料可能从溶液中沉淀。加热Red®至45 - 50℃,2min,搅拌溶解。染料在室温下储存,以避免沉淀。
Q:  后染法需要去除染料的步骤吗?
A
:  不需要,不过高背景的结果可以考虑适当脱色步骤
Q: SafeRed和GelGreen可以用来染色单链DNA或RNA吗?
A:   SafeRed和GelGreen可用于单链DNA和RNA的染色,但SafeRed染单链核酸效果比GelGreen敏感5倍左右。
Q: 用那些仪器检测SafeRed和GelGreen?
A:  SafeRed完美兼容标准(302或312nm)紫外透射成像仪。GelGreen的吸收峰在500nm。 GelGreen兼容254 nm的紫外透射或可见光激发的凝胶成像仪,如Dark Reader或488 nm凝胶激光扫描仪。
Q: 什么样的发射滤波片适合使用SafeRed和GelGreen?
A:   SafeRed使用溴化乙锭滤片; GelGreen使用SYBR Green或黄色滤片。另外,长通道黄色滤片可用于SafeRed或GelGreen。请查阅SafeRed和GelGreen更多的特定的发射光谱。
Q:  可以提前制作SafeRed/GelGreen凝胶,储存供以后使用吗?
A:   可以,SafeRed和GelGreen染料是稳定的。在保证琼脂糖凝胶的完整性不会被破坏的前提下,你可以将预制的SafeRed/GelGreen凝胶储存供以后使用。 我们建议在4℃避光贮存凝胶。
Q: SafeRed/GelGreen在熔化的琼脂糖中稳定么?可以将SafeRed/ GelGreen储存在熔化的琼脂糖胶中,到用的时候在制备凝胶吗?
A:  可以,SafeRed比GelGreen更加稳定。但我们不建议将SafeRed放在熔化的琼脂糖中存放几天。
Q:   SafeRed/GelGreen的预制凝胶可以重复使用吗?
A:   不可以,连续电泳会减少染色强度。
Q:   可以重新融化SafeRed/GelGreen凝胶,再制备吗?
A:   是的,但最好再添加一些染料,保证重新制备凝胶的信号强度。
Q: SafeRed和GelGreen用后应该如何处置?
A:   SafeRed和GelGreen通过TUV认证测试按照美国标准California Department of Fish & Game, 1988 Acute Procedures; EPA/600/4-85/013, 1985 Acute Manual,
在中国农科院通过斑马鱼测试
可以直接倾倒入下水道。但是由于不同国家和地区规定的差异,请联系您当地的安全监管部门,获取相关条例。

Q:  SafeRed及GelGreen与如克隆,连接和测序的下游扩增子兼容吗?
A:  可以。我们建议使用Qiagen公司或Zymoclean凝胶提取试剂盒,EXO-SAP方案,或酚氯仿抽提法去除DNA中的染料成分。由于SafeRed/GelGreen与DNA结合比EB更为紧密,所以需要去除样品DNA中的SafeRed/GelGreen染料,保证DNA的后续操作。
Q:  SafeRed/GelGreen安全性如何?
A:  SafeRed®/GelGreen®经过埃姆斯AMS和相关测试,已经被证明是替代EB和SYBR染料更为安全的产品。不过,请使用这些试剂时,也要遵循实验室安全条例,以免污染DNA等样品。
Q:  SafeRed/GelGreen检测下限是什么?
A:  SafeRed/ GelGreen是超敏感的染料,检测含量<0.1ng的DNA。
Q:  SafeRed/GelGreen的结合机制是什么?
A:  SafeRed/GelGreen通过静电及电荷相互作用与DNA结合。
Q:  SafeRed/GelGreen迁移的方向?
A:  SafeRed和GelGreen相比于EB来说,不容易通过凝胶迁移。不需要在电泳缓冲液中添加额外的染料,凝胶也会比EB染色更均匀。
Q:  SafeRed/GelGreen需要在黑暗中使用吗?
A:  SafeRed和GelGreen是稳定的染料。在室内光线下使用,染料避光储存。
Q:  SafeRed/GelGreen的使用量?
A:   10,000×储备液用于1X甚至0.5X预制凝胶使用量1:10000~1:20000 (例如: 5uL 用于50ml~100mL凝胶),或1:3333比例用于电泳后染色(15uL 用于50 mL溶液)。
Q:  SafeRed/GelGreen电泳后染色可重复使用吗?
A:  可以。如果敏感度降低,则建议更换新鲜的染料溶液。
Q:  SafeRed可以被用于凝胶迁移电泳分析和脉冲凝胶电泳吗?
A:可用于EMSA和PFGE凝胶的电泳后染色。
Q:  SafeRed/GelGreen可以被用于Southern或Northern杂交吗?会干扰转膜或杂交过程吗?
A:   建议使用后染法。
Q:  SafeRed可以被用于基于甲醛的RNA凝胶中?
A:  可以。
Q:  SafeRed能用于聚丙烯酰胺,DGGE技术,EMSA实验或PFGE (脉冲场)凝胶吗?
A:  请使后染法。
Q:  SafeRed可以被用于彗星试验(单细胞凝胶电泳测定技术,一种敏感单链或双链DNA突变和破损的遗传测定方法)?
A:  是。
Q:  SafeRed是否用于碱性凝胶电泳缓冲液(30MM的NaOH,1mM的EDTA)?
A:  是。
Q:  SafeRed可用于氯化铯梯度纯化DNA染色吗?
A:  可以。正丁醇萃取前加SDS至终浓度0.1%去除纯化的DNA中的SafeRed。
Q:  建议用什么方案去除电泳后胶中的GelGreen/SafeRed染料?
A:  使用Zymo Research公司的ZymoClean 凝胶 DNA回收试剂盒,USB/Affymetrix 公司的ExoSap-It 试剂盒、Sigma的GenElute琼脂糖柱。Life Technologies 公司的PureLink快速凝胶回收试剂盒,GE Healthcare公司的Illustra GFX PCR DNA 和 凝胶条带纯化试剂盒、Roche的高纯度PCR产物纯化试剂盒。
Q:  SafeRed和GelGreen两种溶剂,在DMSO和水中的染料是否存在差异?
A:  两种溶剂方案的效果相似。

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